1、預(yù)檢查和調(diào)節(jié)
(1) 在每次進(jìn)行熒光觀測前, 必須例行檢查熒光裝置的燈絲對中、光路對焦、孔徑光闌、視場光闌設(shè)置等狀況。
(2) 所需要的熒光激發(fā)/ 發(fā)射濾光片組件是否已裝在轉(zhuǎn)換器中, 物鏡配置是否得當(dāng), 除去物鏡前透鏡的油漬和灰塵。
(3) 如同時進(jìn)行透射光相差觀察, 要檢查聚光鏡對中心及相差環(huán)與物鏡相反的共軛情況。
(4) 檢查樣品載體(載玻片、蓋玻片和其他器皿) 有否掛有液體、灰塵, 厚度是否在物鏡標(biāo)定的工作距離范圍內(nèi)。切片樣品不能太厚, 約≤10μm 為宜。
(5) 因照明光源含有紫外線, 在載物臺前上方放一塊棕色遮光板, 以防紫外線損傷視網(wǎng)膜。
(6) 電壓不穩(wěn)會降低高壓汞燈的使用壽命, 光源電源最好加配穩(wěn)壓器。
(7) 為延長汞燈壽命, 在開啟后15 min 方可關(guān)閉; 汞燈熒光電源一旦關(guān)閉, 再次啟動至少需等待10 min，以使水銀蒸汽冷卻復(fù)至原態(tài), 否則會影響燈的壽命。
2、熒光鏡像觀察
(1) 在開啟熒光燈源后約5～10min 激發(fā)光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定, 裝載樣品進(jìn)行觀察; 為防止在調(diào)焦和尋找物像過程中過度激發(fā)光照會造成樣品熒光淬滅, 最好先通過縮小熒光照明器的孔徑光闌或加ND 濾光片將激發(fā)光調(diào)節(jié)到適度強(qiáng)度, 有規(guī)律地移動樣品臺, 待確定鏡像后, 再調(diào)節(jié)到最佳熒光狀態(tài)用于拍攝記錄。
(2) 鏡像質(zhì)量不佳的調(diào)整。排除樣品制備因素外, 可進(jìn)行的必要調(diào)節(jié)措施是:
a 排除成像光路中的遮光或限光器件, 如DIC 附件、ND 濾光片等。
b 重新調(diào)節(jié)熒光照明器的收光器對焦和孔徑光闌大小。
c 細(xì)心調(diào)節(jié)物鏡覆蓋差校正環(huán)。
d 復(fù)查熒光激發(fā)/發(fā)射組件是否與所標(biāo)記的熒光色素對應(yīng)。
(3) 在不影響分辨率的前提下, 于照相取景框和CCD靶面范圍之外, 可盡量回縮熒光光路視場光闌和物鏡(100X 物鏡) 的數(shù)值孔徑光闌調(diào)節(jié)環(huán), 以避免雜散光的影響、提高景深, 并可減小激發(fā)面積防止附加樣品淬滅。
(4) 暫時不觀察時, 應(yīng)阻斷激發(fā)光路。
(5) 油鏡觀察時, 須用“無熒光油”, 尤其是在U、V 激發(fā)時, 因常規(guī)鏡檢用的香柏油帶有青色熒光。
3、熒光照相和數(shù)字CCD 相機(jī)圖像采集
A、熒光照相
1)盡管肉眼觀察熒光鏡像亮度與普通明場相差無幾, 而實際上曝光時間要增加數(shù)倍甚至幾十倍, 應(yīng)使用快速感光膠片, 如ISO200 ( 24DIN ) 、ISO400(27DIN) 。
2)根據(jù)熒光物像在測光區(qū)的分布比例和鏡像的明暗程度設(shè)置曝光補(bǔ)償調(diào)節(jié), 原則上適當(dāng)增大補(bǔ)償以獲得背景黑暗熒光圖像明亮、鮮艷的照片效果。
3)如果沒有照明標(biāo)線取景器, 可先選擇較明亮的熒光區(qū)域進(jìn)行對焦調(diào)整。
4)對點狀熒光物像或撲捉某點為主的拍攝, 可選擇適當(dāng)?shù)狞c測光模式。
5)對在同一幅需要同樣條件拍攝的分散點狀熒光物像, 可試用點測光配合自動鎖定方式拍攝。
6)曝光過程應(yīng)避免任何振動, 有條件可配置防震臺。
B、數(shù)字CCD 相機(jī)圖像采集
1)光學(xué)接口的中間倍率要與CCD的芯片尺寸合理匹配。
2)采用合適的熒光拍攝模式, 摸索減背景(Background Subtraction) 處理條件, 根據(jù)鏡像情況設(shè)置Binning、Gain、Gamma 等參數(shù)。
3)因CCD 芯片靈敏度較高,如果熒光鏡像過于明亮,為獲取對比度較好的采集圖像,可適當(dāng)縮小熒光照明器孔徑光闌或加ND濾光片, 特別是在熒光輝光較強(qiáng)影響拍攝樣品細(xì)節(jié)的情況時。
實際工作中,為獲得較好的熒光圖像拍攝質(zhì)量,需要對上述調(diào)節(jié)機(jī)制綜合運用,反復(fù)摸索、優(yōu)化條件。
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